Задать вопрос

Биологическая резистентность к бета-лактамным антибиотикам

В.М.Семенов, И.В.Жильцов, Т.И.Дмитраченко, С.К.Зенькова, В.В.Скворцова, И.С.Веремей

 

Антибиотикоустойчивость бактерий в настоящий момент является одной из наиболее важных и актуальных проблем инфектологии. Практически все известные науке бактерии-возбудители инфекционных заболеваний (за редким исключением) в большей или меньшей степени проявляют устойчивость к тем или иным антибактериальным препаратам.
С момента эпохального открытия пенициллина в 1928 г. антибиотики оказывали глубокое влияние на качество человеческой жизни. Возможность лечить и излечивать смертельные бактериальные инфекции навсегда изменила медицину, принеся облегчение от боли, радикально уменьшив страдания и снизив смертность. Пенициллин и его многочисленные производные доминировали среди других антибиотиков, демонстрируя беспрецедентный успех в лечении бактериальных инфекций по всему миру.


Об авторах

Семенов Валерий Михайлович доктор медицинских наук, профессор, декан лечебного факультета Витебского государственного медицинского университета, Председатель Научного общества инфекционистов Республики Беларусь, член Международного Союза за разумное использование антибиотиков (APUA), Председатель белорусского отделения APUA;член Международной ассоциации клинических микробиологов и химиотерапевтов (IACMAC), Председатель белорусского отделения Международного общества химиотерапевтов (ISC), член ISC и Европейского общества инфекционистов и микробиологов (ESCMID), зам. председателя Международного Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням.

Жильцов Иван Викторович кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней Витебского государственного медицинского университета, член Научного общества инфекционистов Республики Беларусь, член Международного Союза за разумное использование антибиотиков (APUA), секретарь белорусского отделения APUA;член Международной ассоциации клинических микробиологов и химиотерапевтов (IACMAC), секретарь белорусского отделения Международного общества химиотерапевтов (ISC), член ISC и Европейского общества инфекционистов и микробиологов (ESCMID), член Международного Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням.

Дмитраченко Татьяна Ивановна доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней Витебского государственного медицинского университета, член Научного общества инфекционистов Республики Беларусь, член Международного Союза за разумное использование антибиотиков (APUA), член Международной ассоциации клинических микробиологов и химиотерапевтов (IACMAC), член ISC и Европейского общества инфекционистов и микробиологов (ESCMID), член Международного Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням.

Зенькова Светлана Константиновна кандидат медицинских наук, ассистент кафедры инфекционных болезней Витебского государственного медицинского университета, член Научного общества инфекционистов Республики Беларусь, член Международного Союза за разумное использование антибиотиков (APUA), член Международной ассоциации клинических микробиологов и химиотерапевтов (IACMAC), член ISC и Европейского общества инфекционистов и микробиологов (ESCMID), член Международного Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням.

Скворцова Виктория Валерьевна кандидат медицинских наук, ассистент кафедры инфекционных болезней Витебского государственного медицинского университета, член Научного общества инфекционистов Республики Беларусь, член Международного Союза за разумное использование антибиотиков (APUA), член Международной ассоциации клинических микробиологов и химиотерапевтов (IACMAC), член ISC и Европейского общества инфекционистов и микробиологов (ESCMID), член Международного Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням.

Веремей Игорь Святославович ведущий лаборант кафедры инфекционных болезней Витебского государственного медицинского университета.

Взяв бензилпенициллин за основу, фармацевты разработали ряд его производных с расширенным спектром активности, составивших класс т.н. бета-лактамных антибиотиков. Бета-лактамы – семейство антибиотиков, имеющих более 6 структурных разновидностей, каждая из которых включает 2-ацетидиноновое кольцо. Они проявили необычайно высокую активность против широкого спектра бактериальных патогенов, обладая при этом низкой (если не нулевой) токсичностью для клеток млекопитающих. Принято считать, что антибиотики бета-лактамной группы – самые удачные антибактериальные препараты с начала эры антибиотиков.
Тем не менее, за последние 60 лет частота и уровень устойчивости бактерий к бета-лактамам неуклонно возрастали, вплоть до настоящего момента, когда многие считают, что бета-лактамы вскоре окажутся неспособными бороться с тяжелыми бактериальными инфекциями. Устойчивость бактерий к бета-лактамным антибиотикам и ингибиторам бета-лактамаз – непрерывно растущая проблема, приводящая к снижению клинической эффективности лекарств, образующих краеугольный камень арсенала антибиотиков.
Антибиотикоустойчивость к любым антибактериальным препаратам, включая бета-лактамы, может быть обусловлена четырьмя основными механизмами: 1) предупреждением взаимодействия лекарства с его мишенью (как правило, вследствие обусловленных мутациями в соответствующих генах изменений структуры собственно белков-мишеней), 2) выбросом антибиотика из клетки, 3) непосредственным разрушением либо модификацией антибиотика (т.е. его ферментативной деградацией), и 4) снижением проницаемости наружной мембраны для антибиотиков, вызванным изменением структуры мембранных липополисахаридов и белков (поринов). Гидролиз антибиотиков имеет наибольшую значимость для клиники, особенно в отношении бета-лактамов. В то же время, метод модификации антибиотиков отличается наибольшим разнообразием вариантов и включает ацетилирование, фосфорилирование, гликозилирование, рибозилирование, присоединение тиолов и нуклеотидов. Уникальное свойство ферментов, способных физически модифицировать антибиотики – их способность в одиночку активно снижать концентрацию соответствующих препаратов в локальном окружении. Ферментативная деградация бета-лактамов вследствие продукции бета-лактамаз возбудителями различных заболеваний – важный, но далеко не единственный механизм устойчивости бактерий к данным антибактериальным препаратам.

1. Продукция бета-лактамаз – основной механизм устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам

Природная либо приобретенная способность продуцировать бета-лактамазы – ферменты, способные гидролизовать эндоциклическую пептидную связь в бета-лактамных антибиотиках, – является основным механизмом постоянно возрастающей резистентности бактерий к данному классу антибактериальных препаратов. На данный момент выявлены 4 основных класса бета-лактамаз – А, В, С и D. Ферменты, принадлежащие к классам А, С и D, содержат боковой радикал серина, являющийся донором электронов в механизме катализа, в то время как ферменты класса В нуждаются в Zn2+ для реализации своей биологической функции. К числу известных бета-лактамаз относятся SHV и TEM из класса А и их производные – БЛРС, а также ингибитор-резистентные ферменты, т.н. ни-TEM, ни-SHV, и карбапенемазы. К классу В относятся металлобеталактамазы, к классу С – хромосомные бета-лактамазы, и к классу D – БЛРС, карбапенемазы и оксациллиназы OXA-типа. Всего известно 255 типов бета-лактамаз, и постоянно появляются новые их разновидности. Новые бета-лактамазы появляются в ответ на широкое клиническое применение новых классов бета-лактамных антибиотиков, что создает необходимое для процесса селекции эволюционное давление.
Способность к продукции различных типов бета-лактамаз в различных концентрациях была выявлена у множества бактерий, как грам(+), так и – в особенности – грам(-). Практически все бактерии способны синтезировать данные ферменты. Микроорганизмы могут иметь природную способность продуцировать бета-лактамазы благодаря наличию соответствующих генов в своей хромосоме, либо приобретают данную возможность после успешной трансдукции ДНК от другого микроорганизма (обычно в составе перевиваемых R-плазмид). Вероятно, гены антибиотикорезистентности существовали в ограниченном количестве бактерий и до эры антибиотиков, но широкое внедрение антибиотиков в клиническую практику привело к их селекции и появлению большого количества новых устойчивых штаммов. Уровень продукции бета-лактамаз может быть стабильным, неиндуцируемым (конституциональная продукция фермента), либо может усиливаться под воздействием избранных бета-лактамных антибиотиков (индуцибельная продукция фермента).
Общепризнанно, что формирование новых бета-лактамаз с измененными структурой и механизмом действия – наиболее распространенный механизм адаптации микроорганизмов к введению в клиническую практику новых бета-лактамных препаратов (т.е., фактически, ответ бактерий на эволюционное давление, создаваемое применением соответствующих схем терапии), особенно среди грам(-) бактерий. Традиционное объяснение этого феномена – случайные мутации и горизонтальный перенос генов устойчивости с их последующей амплификацией. Типичный пример точечных мутаций, приводящих к расширению субстратного спектра бета-лактамаз – широко известные и повсеместно распространенные бета-лактамазы TEM-1, передаваемые перевиваемыми плазмидами грам(-) бактерий. Традиционные плазмидные бета-лактамазы первоначально обнаруживались только у представителей семейства Enterobacteriaceae, но к настоящему времени распространились и на другие роды и виды, включая P. aeruginosa, H. influenzae и N. gonorrhoeae. У энтеробактерий же (в особенности у Klebsiella spp. и E. coli) были впервые выявлены плазмидные БЛРС, способные гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины, а также цефалоспорины 2 и 3 поколения. Природные варианты TEM-1 с повышенной способностью гидролизовать бета-лактамы широкого спектра, как, например, цефтазидим, и/или устойчивые к ингибиторам бета-лактамаз, появляются в ответ на широкое применение соответствующих антибиотиков. Типичная мутация, возникающая в подобных условиях – замена единичной аминокислоты M182T, которая встречается только в комбинации с другими точечными мутациями, вероятно, восстанавливающими нарушенную другими мутациями биологическую функциональность и специфичность данного фермента. Аналогичное явление четко прослеживается на примере типичного для семейства энтеробактерий ферментов SHV, в которое входит наибольшее количество известных в настоящее время бета-лактамаз. Первая описанная бета-лактамаза SHV имела узкий спектр активности, но накопление точечных мутаций привело к появлению новых форм указанных ферментов с измененным активным центром, т.н. SHV-1. Представители группы SHV-1 либо имеют расширенный спектр активности, включающий цефалоспорины третьего поколения, либо устойчивы к ингибиторам бета-лактамаз. Всего описано более 150 разновидностей БЛРС. Препаратами выбора для лечения заболеваний, вызванных БЛРС-продуцирующими штаммами, остаются карбапенемы (в первую очередь – имипенем/циластатин).
Из всего многообразия известных бета-лактамаз наибольшую клиническую значимость имеют ферменты классов А и С. Широкое использование карбапенемов привело к росту значимости и металло-бета-лактамаз класса В, способных гидролизовать карбапенемы. Вообще, Zn2+-зависимые бета-лактамазы разрушают большинство известных бета-лактамных антибиотиков. В рамках класса А сравнительно недавно была открыта металло-независимая карбапенемаза, имеющая широкий субстратный спектр и способная разрушать карбапенемы. Понимание огромного разнообразия антибиотик-модифицирующих ферментов объясняет, почему до сих пор существует так мало эффективных ингибиторов данных ферментов.
В качестве глобальной тенденции последних десятилетий можно отметить постоянный рост уровня приобретенной устойчивости бактерий (прежде всего – энтеробактерий) к стабильным бета-лактамам широкого спектра (цефалоспорины 3-4 поколений, монобактамы и карбапенемы), имеющим в настоящее время огромное клиническое значение; при этом постоянно выявляются разнообразные плазмиды, кассеты генов либо интегроны, кодирующие новые бета-лактамазы.
Генетические процессы, ответственные за данную эволюцию, можно подразделить на 2 типа: А) эволюция «старых» бета-лактамаз путем точечных мутаций в соответствующих генах, и В) появление новых генов резистентности, нередко заимствованных от непатогенных бактерий окружающей среды. Кроме мутантных вариантов классических пенициллиназ TEM и SHV, устойчивость к цефалоспоринам третьего поколения опосредуют 1) несколько разновидностей БЛРС класса А, преимущественно типа CTX-M (например, CTX-M-40), а также более редкие виды, в частности, BES, GES, PLA, PER, VEB, и 2) перевиваемые цефалоспориназы класса С (AmpC), обычно кодируемые хромосомными генами, но, тем не менее, способные перемещаться между штаммами Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Morganella morganii, Aeromonas caviae, Proteus vulgaris, Pseudomonas spp., Providencia spp., Serratia spp., а также различными неферментирующими бактериями, включая Acinetobacter spp. Однако, гены, ответственные за продукцию бета-лактамаз AmpC, могут локализоваться не только на хромосоме, но и в плазмидах. Такие гены кодируют бета-лактамазы следующих типов: ACC-1, ACT-1, CFE-1, группа CMY, DHA-1, группа FOX, MIR-1, MOX-1. Цефалоспориназы AmpC имеют более широкий спектр субстратной специфичности, чем БЛРС, включающий цефалоспорины 3-го поколения, цефамицины и ингибиторы бета-лактамаз. Продукция данных ферментов может быть индуцирована воздействием определенных бета-лактамных антибиотиков (например, цефтазидима или цефокситина). Случайные мутации могут приводить к гиперпродукции хромосомных цефалоспориназ, что делает соответствующие штаммы энтеробактерий устойчивыми к большинству реально применяемых бета-лактамных антибиотиков. Препараты выбора для лечения соответствующих инфекций – цефалоспорины 4 поколения и карбапенемы, но комбинация высокого уровня продукции БЛРС и неферментативных механизмов резистентности ведет к устойчивости даже к этим препаратам резерва.
Обычно считалось, что устойчивость к карбапенемам ограничивается P. aeruginosa, но затем данное явление было расширено на Acinetobacter baumannii, а в конечном итоге – и на прочие энтеробактерии; устойчивость такого типа обусловлена продукцией новых ферментов (классов А, В и D), а именно IMP, VIM SME, GIM, OXA, KPC. Выдающийся пример эволюции в направлении неуклонного нарастания антибиотикоустойчивости – представители рода Salmonella. E. coli и K. pneumoniae также способны продуцировать плазмидные БЛРС, принадлежащие к классу А. Наиболее часто БЛРС-продуцирующие штаммы вышеперечисленных бактерий выявляются во время вспышек вызываемых ими инфекций, особенно в отделениях интенсивной терапии, что приводит к возрастанию стоимости лечения и продолжительности госпитализации. При этом резервуарами БЛРС-продуцирующих штаммов могут быть не только пациенты из закрытых коллективов, но и амбулаторные пациенты с хроническими заболеваниями.
Устойчивость патогенных стафилококков к бета-лактамным антибиотикам опосредуется не только ПСБ 2а со сниженной аффинностью к пенициллину, но и продукцией бета-лактамаз, преимущественно – плазмидных (выявлена не менее чем у половины исследованных штаммов MRSA). При этом данный механизм обусловливает формирование умеренного уровня устойчивости стафилококков к бета-лактамам. Кроме того, отдельные штаммы стафилококков способны продуцировать БЛРС.
В то же время существуют исключения из общего правила – немногочисленные патогенные микроорганизмы, вплоть до настоящего времени абсолютно чувствительные к бета-лактамным антибиотикам вследствие неспособности продуцировать бета-лактамазы (и отсутствия других известных неферментативных механизмов резистентности). В качестве примера можно привести Streptococcus agalactiae, который до сих пор сохраняет чувствительность к бета-лактамам; он вызывает инфекции у беременных женщин и новорожденных.
Безуспешные попытки создать ингибитор бета-лактамаз предпринимались с конца 40-х гг. В начале 50-х гг. было обнаружено, что некоторые полусинтетические пенициллины могут ингибировать бета-лактамазы, но клинического применения данному феномену не нашлось. В 1967 г. стартовала программа поиска продуцируемых микроорганизмами естественных ингибиторов бета-лактамаз. Это исследование привело к открытию оливановых кислот и клавулановой кислоты. Клавулановая кислота, скомбинированная с амоксициллином, а позднее – с тикарциллином, вошла в клиническую практику в 1981 г. Позднее были открыты и другие ингибиторы бета-лактамаз: сульбактам и тазобактам. До сих пор не ясно, имеют ли они преимущества перед клавулановой кислотой. Для клинического применения пока доступны только вышеупомянутые соединения. Клавулановая кислота представляет собой природный клавам, сульбактам и тазобактам – сульфоны пенициллановой кислоты, все три вещества структурно подобны бета-лактамным антибиотикам, на чем и основано их функционирование в качестве конкурентных ингибиторов бета-лактамаз (класса А). Принцип действия описываемых соединений – конкурентное ингибирование, т.е. масс-габаритное вытеснение субстрата (бета-лактамного антибиотика) из активного центра бета-лактамаз за счет сходства химической структуры ингибиторов и бета-лактамных препаратов. Ключевые аминокислоты, с которыми связываются ингибиторы – Met 69, Ser 130, Arg 244, Arg 275 и Asn 276. Блокирование Ser130 – ключевой момент собственно ингибирования. Точечные замены упомянутых аминокислот приводят к снижению эффективности ингибирования. Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы отличаются от исходных TEM-1 и TEM-2 заменами одной, двух или трех аминокислот различной локализации. Конкурентное ингибирование, с одной стороны, эффективно лишь при поддержании достаточной концентрации ингибиторов в месте действия антибиотика (интенсивность конкурентного вытеснения снижается пропорционально концентрации ингибитора), а с другой стороны, такое ингибирование ни при каких условиях не может быть стопроцентным, полным. Кроме того, подобное ингибирование обратимо.
Вышеперечисленные ингибиторы существенно повышают эффективность комбинируемых с ними бета-лактамов при лечении тяжелых инфекций, вызванных энтеробактериями и пенициллин-устойчивыми стафилококками. Для клинического применения широко используется комбинация бета-лактамов с ингибиторами бета-лактамаз. Хотя существуют очень удачные варианты таких комбинаций, большая часть конкурентных ингибиторов эффективно подавляет активность бета-лактамаз класса А и бесполезна против классов В, С и D.
В настоящее время в клинической практике используется 4 комбинации бета-лактамов с ингибиторами бета-лактамаз: ампициллин-сульбактам, амоксициллин-клавуланат, тикарциллин-клавуланат и пиперациллин-тазобактам. Тикарциллин-клавуланат и пиперациллин-тазобактам имеют наиболее широкий спектр активности, включающий Pseudomonas aeruginosa. На активность подобных комбинаций влияет много факторов, включая фармакокинетику ингибитора, тип и количество бета-лактамаз, продуцируемых целевым микроорганизмом, а также способность ингибитора индуцировать экспрессию хромосомных цефалоспориназ. Хотя тикарциллин-клавуланат и пиперациллин-тазобактам имеют одинаковые спектры активности, между ними имеется и ряд различий. Наиболее существенные – повышенная активность пиперациллина против энтеробактерий и P. aeruginosa, а также повышенная активность пиперациллин-тазобактама против грам(-) возбудителей, продуцирующих бета-лактамазы класса PSE либо другие плазмидные бета-лактамазы; кроме того, фармакокинетика тазобактама лучше, чем у клавулановой кислоты. При лечении синегнойных инфекций клавуланат обладает способностью индуцировать экспрессию хромосомных цефалоспориназ, разрушающих тикарциллин, в то время как тазобактам не имеет такой особенности. Помимо этого, тикарциллин/клавуланат обладает значимой активностью против многих бактерий, включая стрептококки, Staphylococcus aureus, Bacteroides fragilis и многочисленные энтеробактерии. Амоксициллин/клавуланат и ампициллин/сульбактам демонстрируют клинически значимую активность против стрептококков (включая энтерококки), S. aureus, B. fragilis и некоторых энтеробактерий. Тикарциллин/клавуланат показан для лечения тяжелых инфекционных заболеваний, включая септицемию. Амоксициллин/клавуланат полезен при лечении бактериальных инфекций верхних дыхательных путей, мочевыделительной системы, кожи и мягких тканей. Ампициллин/сульбактам может использоваться для лечения интраабдоминальной патологии, гинекологических инфекций, заболеваний мочевыводящих путей, кожи и мягких тканей.
Селективное давление от избыточного использования комбинаций антибиотиков с ингибиторами бета-лактамаз ускорило формирование резистентности к таким сочетаниям за счет образования новых мутантных бета-лактамаз расширенного спектра, устойчивых к комбинированным препаратам. Недавние исследования структуры бета-лактамаз класса А (именно, TEM и SHV) расширили их спектр: были открыты т.н. БЛРС и карбапенемазы – Sme, NMC-A, IMI-1, что привело ученых к пониманию возможности развития устойчивости к ингибиторам бета-лактамаз. Более того, распространение хромосомных ферментов класса С (CMY, MIR), растущая клиническая роль ферментов класса В (IMP, VIM), появление ингибитор-резистентных бета-лактамаз широкого спектра класса D (OXA) и одновременно возможность продукции бета-лактамаз различных классов одним и тем же возбудителем подстегнули исследования, направленные на создание универсальных ингибиторов. В результате было создано несколько новых ингибиторов широкого спектра – цефем-сульфоны, оксапенемы (причем цефем-сульфоны, вероятно, способны ингибировать металло-бета-лактамазы класса В), а также боронаты и фофонаты, являющиеся принципиально новыми классами ингибиторов, базирующихся на общих структурных и функциональных особенностях сериновых бета-лактамаз.

2. Факторы макроорганизма, снижающие эффективность этиотропной терапии антибиотиками бета-лактамного ряда

Вплоть до настоящего времени антибиотикоустойчивость болезнетворных бактерий рассматривалась лишь как приспособительная реакция микроорганизмов. При этом исследователи и клиницисты традиционно не принимают во внимание, что организм человека, со своей стороны, также небезразличен к введению антибиотиков. Антибиотики являются для макроорганизма чужеродными веществами, от которых он стремится освободиться, используя для этого разнообразные механизмы.
Так, общеизвестна система окислительной деградации чужеродных соединений, включая бета-лактамные антибиотики, под воздействием системы цитохромов Р450 (в основном 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 и 3A4), преимущественно в печени; тем не менее, для бета-лактамов данный путь разрушения не является основным. Существуют и другие пути распада антибиотиков в организме; в частности, показано, что гемолизированная кровь может разрушать 3-ацетоксиметил-цефалоспорины (цефалотин, цефотаксим) посредством деацетиляции 3-ацетоксиметильной группы. Данное наблюдение показывает, что антибиотики бета-лактамного ряда в принципе могут разрушаться какими-либо компонентами цельной крови, плазмы либо сыворотки крови. Помимо этого, давно известно, что имипенем разрушается почечными дегидропептидазами, причем продукты распада нейротоксичны; именно поэтому в состав коммерческого препарата имипенема был введен ингибитор почечных дегидропептидаз циластатин. Также было показано, что аналоги карбапенемов (в частности, 2-метилпенем-3-карбоксиловая кислота, или BCL-98) гидролизуются альбуминами человеческой крови, причем данную активность опосредуют участки альбуминов, содержащие аминокислоты лизин и L-триптофан.
Феномен собственной бета-лактамазной активности человеческой крови известен достаточно давно. Так, в 1972 г. группа исследователей компании Glaxo Research Ltd, изучая свойства недавно синтезированного ими хромогенного цефалоспорина нитроцефина, описала значимый распад бета-лактамной связи данного антибиотика под воздействием, в числе прочего, сыворотки человеческой крови, причем данное ее свойство опосредовалось в первую очередь альбуминовой фракцией.
В 1994 г. научный коллектив во главе с B. Nerli повторно описал феномен интенсивного распада нитроцефина под воздействием человеческого сывороточного альбумина (ЧСА). Однако, клиническое значение феномена не исследовалось, и в результате явление необычно высокой собственной бета-лактамазной активности человеческой крови осталось незамеченным научным сообществом. Кроме того, неудачей окончилась попытка локализовать активный центр молекулы альбумина, ответственный за катализ: предложенная пространственная структура, включающая Lys 199, Tyr 411, Trp 214, Lys 195, Lys 225, Lys 240 и His 146, в действительности не могла быть активным центром, поскольку перечисленные аминокислоты на самом деле размещались в разных участках реконструированной молекулы альбумина, достаточно далеко отстоящих друг от друга.
В последующие годы было предпринято углубленное исследование данного феномена. В частности, убедительно доказано, что бета-лактамазная активность – неотъемлемое свойство человеческой крови. Помимо ЧСА, большинство белковых фракций крови обладает бета-лактамазной активностью, составляющей приблизительно 9,6% от общей сывороточной. Собственной бета-лактамазной активностью обладают также и поликлональные IgG.
Установлен ряд особенностей сывороточной бета-лактамазной активности, в частности, оптимум рН (9,0) (рис.1), зависимость скорости реакции от температуры (при повышении температуры до 39-40°С экспоненциально возрастает) (рис. 2) и ионной силы раствора (снижается при повышении ионной силы выше уровня, типичного для плазмы крови) (рис. 3), изучена кинетика распада цефалоспоринов, катализируемого ЧСА (реакция первого порядка с Кm=0,115). Уровень бета-лактамазной активности ЧСА критически зависит от сохранности его третичной структуры, но не зависит от присутствия кофакторов. Доказано наличие в составе молекулы альбумина активного центра, ответственного за связывание бета-лактамных антибиотиков и разрушение бета-лактамов, смоделирована его трехмерную структуру и аминокислотный состав, а также реконструирован механизм катализа (напоминает таковой у бактериальных бета-лактамаз класса А). Данный участок с очень высокой степенью вероятности включает аминокислотные остатки GLN 196, ALA 291, ARG 257, LYS 195, HIS 288, SER 192, GLU 153, GLU 292, TYR 150, GLU 188 и ARG 160 (рис. 4). Кроме того, в состав активного центра со значительной долей вероятности могут входить также HIS 242, PHE 157, ASP 451, LYS 199, CYS 245 и TYR 148. Все вышеперечисленные аминокислоты располагаются в молекуле ЧСА недалеко друг от друга, в своеобразном углублении, называемом «гидрофобный карман». Медиана количества аминокислотных остатков, непосредственно взаимодействующих с одной молекулой антибиотика, составляет 15 (95% ДИ: 14…16). Молекулы различных бета-лактамных антибиотиков могут располагаться в описанном выше довольно протяженном участке связывания по-разному, взаимодействуя, кроме перечисленных «общих» аминокислотных остатков, еще с десятком различных аминокислот, включая ASP 108, HIS 146, PRO 147, PHE 149, SER 193, CYS 200, TRP 214, ARG 218, ARG 222, TYR 452 и другие. Особняком стоят сульбактам и тазобактам, которые связываются с молекулой альбумина в другом участке, образованном аминокислотными остатками PRO 384, LEU 387, ILE 388, ASN 391, GLY 434, ALA 449 и ARG 485. В отличие от сульбактама и тазобактама, клавулановая кислота связывается с тем же участком молекулы ЧСА, что и бета-лактамные антибиотики. Указанное явление позволяет объяснить вдвое меньшую эффективность ингибирования бета-лактамазной активности ЧСА тазобактамом по сравнению с клавулановой кислотой в такой же концентрации.
Сравнение аминокислотных последовательностей ЧСА и различных бета-лактамаз выявило наличие у них общего участка – короткой последовательности KQRLK (лизин–глутамин–аргинин–лейцин–лизин); в первичной структуре альбумина данные аминокислоты занимают позиции со 195-й по 199-ю. В молекуле пенициллиназы blaZ аналогичные аминокислоты занимают позиции со 140-й по 144-ю. Из вышеприведенных результатов молекулярного моделирования следует, что по крайней мере три аминокислоты из данной последовательности (LYS 195, GLN 196 и LYS 199) участвуют в формировании активного центра молекулы ЧСА, ответственного за сорбцию бета-лактамных антибиотиков. Данные аминокислоты имеют отношение к процессу катализа, т.к. последовательность KQRLK относится к консервативным и с большим постоянством выявляется в структуре разнообразных бета-лактамаз.
Помимо этого, был строго доказан факт распада бета-лактамных антибиотикова (имипенема, бензилпенициллина, азтреонама и цефалексина и др.) под воздействием ЧСА (рис. 5).
Особняком стоит феномен формирования в человеческом организме иммуноглобулинов, обладающих бета-лактамазной активностью, т.н. «абзимов» (каталитических антител). Исследования, выполненные в ведущих научных лабораториях во многих странах, убедительно показали, что антитела могут вмешиваться в лиганд-рецепторные взаимодействия любой природы, то есть фактически способны выполнять функции любых молекул–трансмиттеров биологического регуляторного воздействия, а также ферментов (энзимов). Согласно современным представлениям, каталитические антитела («абзимы») формируются в организме в естественных условиях как одно из звеньев иммунологической сети Ерне (т.н. антитела второго порядка). Схема их образования выглядит следующим образом: антиген, попав в организм, приводит к образованию антител первого порядка, то есть антител, способных специфически связывать соответствующий антиген. Образующиеся таким образом антитела, как правило, принадлежат к различным пулам, имеют неодинаковую антигенную специфичность и обладают различной авидностью. В процессе развёртывания гуморального иммунного ответа образуется большое число разновидностей антител, которые в совокупности способны связывать («опсонизировать») и нейтрализовывать внедрившийся антиген, а в отдельности реагируют с различными антигенными детерминантами указанного антигена. В целом это приводит к тому, что в организме образуются (в большем или меньшем количестве) антитела практически ко всем антигенным детерминантам внедрившегося антигена. В случае, если антиген представляет собой фермент, в числе прочих образовавшихся к нему антител неизбежно окажутся антитела к активному центру фермента. Согласно теории иммунологических сетей Ерне, к связывающим сайтам антител первого порядка образуются антитела второго порядка. Ввиду этого связывающий сайт антитела второго порядка будет до известной степени структурно подобен исходному антигену. Ерне полагал, что существование антител второго порядка необходимо для поддержания напряжённости иммунного ответа. С точки зрения последователей теории иммунологических сетей, антитела второго порядка являются для системы иммунологической памяти своего рода «действующими моделями антигенов». Если антигенной детерминантой для формирования антитела первого порядка послужил активный центр фермента, то связывающий центр антитела второго порядка будет до известной степени представлять собой структурный аналог активного центра исходного фермента. Можно ожидать, что антитело второго порядка будет способно проявлять соответствующую ферментативную активность, причём эта активность будет тем более выражена, чем более точным структурным аналогом активного центра исходного фермента будет являться связывающий участок антитела второго порядка.
До настоящего времени практически все известные абзимы были получены искусственно (in vitro или in vivo). Лишь в последнее десятилетие появились немногочисленные и разрозненные публикации, посвящённые обнаружению каталитических антител in vivo при различной патологии (прежде всего при заболеваниях аутоиммунной природы или со значительным аутоиммунным компонентом в патогенезе – системной красной волчанке, ревматоидном артрите, аутоиммунном тиреоидите, бронхиальной астме). ДНК-гидролизующие антитела были обнаружены в крови больных при ряде инфекционных заболеваний. Таким образом, несмотря на малочисленность публикаций, были получены весомые доказательства того, что 1) в организме человека при ряде патологических состояний обнаруживаются абзимы с различной специфичностью активности, и 2) эти абзимы могут играть заметную роль в патогенезе соответствующих заболеваний.
Экспериментально доказано, что при инфекционных заболеваниях, вызванных пенициллиназо-продуцирующими возбудителями (в частности, при пневмонии, вызванной P. aeruginosa), возможно образование антител к бактериальной пенициллиназе соответствующего типа. Установлена возможность формирования абзимов, обладающих пенициллиназной активностью, in vivo при иммунизации мышей пенициллиназой.
С учётом вышеприведенных положений, появляются новые подходы к объяснению некоторых наблюдаемых в клинике феноменов. Так, при ряде инфекционных заболеваний описана клиническая (то есть in vivo) неэффективность различных бета-лактамных антибиотиков, которые in vitro эффективно подавляли жизнедеятельность возбудителей соответствующих заболеваний, и в том числе аутоштаммов, выделенных у изучаемых больных. Данное явление может объясняться как особенностями локализации возбудителей в организме человека и фармакокинетикой конкретных антибактериальных препаратов, так и наличием в крови больного значительного титра каталитических антител, способных эффективно гидролизовать соответствующие антибиотики. Кроме того, длительная экспозиция организма к бактериальным бета-лактамазам, которая может иметь место при тяжёлых и длительно протекающих инфекциях (особенно осложненных распадом тканей), может привести к нарастанию «биологической» антибиотикоустойчивости, так как способствует формированию более высоких титров абзимов с бета-лактамазной активностью и, соответственно, разрушению дополнительных количеств введённых в организм антибиотиков.

3. Регистрация биологической резистентности к бета-лактамным антибиотикам

С целью регистрации бета-лактамазной резистентности к антибиотикам возможно применение тест-системы «БиоЛактам», предназначенной для выявления и количественной оценки бета-лактамазной активности в биологических субстратах, допускающих приготовление прозрачной вытяжки (фильтрата), прежде всего – в сыворотке крови, мокроте, спинномозговой жидкости (ликворе), ротовой жидкости (слюне), моче, а также в бактериальной суспензии.
В основе функционирования тест-системы «БиоЛактам» лежит хроматографическая методика, базирующаяся на изменении окраски синтетического антибиотика цефалоспоринового ряда при распаде его бета-лактамной связи. При этом происходит батохромный сдвиг в хромофорной системе молекулы, и окраска реакционной смеси меняется с желтой на красно-оранжевую. Максимум поглощения продукта реакции меняется с 390 нм на 486 нм, что и делает возможным спектрофотометрическую детекцию. Бета-лактамазная активность оценивается в % распада стандартного количества используемого цефалоспорина, вносимого в пробу.
Для автоматизации учета результатов анализов разработана специализированная программа «Интерком» (актуальная версия 1.5). Указанная программа способна управлять планшетным ридером, подключенным к персональному компьютеру с установленной операционной системой Windows 98, 2000, ХР, Vista или 7. Данная программа автоматически производит замеры оптической плотности в ячейках иммунологического планшета, выводит результаты замеров в виде таблицы, а также рассчитывает уровень бета-лактамазной активности в каждой пробе (при условии, что пробы были размещены в планшете в соответствии с прилагаемой схемой) и выделяет все значения активности, превышающие указанный исследователем пороговый уровень. Программа позволяет вести протокол: можно непосредственно перед замерами указать номера обрабатываемых проб соответственно их реальному расположению в иммунологическом планшете, а также вписать ФИО исследователя и название учреждения; текущие дата и время заносятся в протокол автоматически. Все результаты замеров и вычислений можно сохранить в файл формата *.csv, совместимый со всеми версиями MS Excel. Программа снабжена стандартной схемой размещения проб и краткой инструкцией по применению.

3.1. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности бактериальной взвеси при помощи тест-системы «БиоЛактам»

Исходным материалом для приготовления суспензий являются чистые культуры бактерий, растущие на поверхности питательных сред (Эндо либо Ресселя – для энтеробактерий, желточно-солевом агаре – для стафилококков) в пробирках с «косым агаром». В пробирку с питательной средой вносится 2-3 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия. После этого пробирка энергично встряхивается до тех пор, пока жидкость над агаром не станет опалесцирующей. Затем жидкость извлекается из пробирки и (при необходимости) разводится стерильным физиологическим раствором хлорида натрия до 0,5 ЕД стандарта мутности Макфарланда путем сравнения с эталоном. Чувствительность анализа заметно повышается, если бактериальная взвесь перед анализом подвергается однократному замораживанию – оттаиванию.
При уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии, равном или превышающем 8,7%, соответствующий возбудитель продуцирует клинически значимые количества бета-лактамаз, что приводит к существенному снижению эффективности антибиотиков бета-лактамного ряда (кроме цефалоспоринов 3-4 поколения, карбапенемов, монобактамов и ингибитор-защищенных препаратов). При сравнении с диско-диффузионным методом в качестве референсного чувствительность методики составляет 76,4% (95% CI: 64,9…85,6), специфичность – 82,8% (95% CI: 70,6…91,4), р<0,0001.
Если определенная в процессе эксперимента бета-лактамазная активность бактериальной взвеси равна или превышает 13,4%, то соответствующий возбудитель устойчив также и к ингибитор-защищенным бета-лактамам. При сравнении с диско-диффузионным методом в качестве референсного чувствительность методики составляет 79,2% (95% CI: 65,0…89,5), специфичность – 79,3% (95% CI: 68,9…87,4), р<0,0001.
Тест-система «БиоЛактам» позволяет с высокой степенью достоверности получать ряд важных сведений об устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам бета-лактамного ряда, что является необходимым условием для проведения рациональной антибактериальной терапии.
Тест-система «БиоЛактам» не конкурирует с диско-диффузионным методом, а дополняет его, позволяя получать важную информацию о природе антибиотикоустойчивости микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний. К числу преимуществ тест-системы «БиоЛактам» относится небольшое время, необходимое для анализа (0,5-1 час) по сравнению с диско-диффузионным методом (от 24 часов), а также высокая воспроизводимость результатов (традиционно слабое место диско-диффузионного метода).
Разработанная тест-система оптимальна для определения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам бактерий (различных штаммов кишечной палочки, псевдомонад, сальмонелл, шигелл, цитробактера, протея, клебсиелл, гемофилов и др.), поскольку их устойчивость к бета-лактамным антибиотикам опосредуется почти исключительно продукцией разнообразных бета-лактамаз.

3.2. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности в мокроте при помощи тест-системы «БиоЛактам»

Образцы мокроты для исследования должны быть получены при фибробронхоскопии, чтобы избежать контаминации микрофлорой полости рта, в массе своей способной продуцировать бета-лактамазы. Собранная при фибробронхоскопии мокрота может до исследования сохраняться при ?20°С.
Перед исследованием пробирки с образцами мокроты 1) выдерживаются в ультразвуковой ванне в течение 30 минут при 37°С с целью дезинтеграции плотных комочков мокроты и гноя и перехода их содержимого в раствор; 2) интенсивно встряхиваются на вортексе в течение 5 минут до полного перемешивания содержимого, и 3) центрифугируются при 12.000 об/мин в течение 5 минут. По окончании центрифугирования отделяется прозрачный надосадок, который используется для анализа, вязкая же часть мокроты (осадок) аннулируется. В случае, если объем прозрачного надосадка слишком мал, в пробирку добавляется 0,5 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия, после чего процесс обработки повторяется с пункта 2.
Согласно результатам проведенных нами исследований, бета-лактамазная активность мокроты обусловлена прежде всего продукцией бета-лактамаз бактериями – возбудителями бронхолегочных заболеваний, а уровень данной активности пропорционален интенсивности продукции бета-лактамаз. Высокий уровень бета-лактамазной активности мокроты у больных с бактериальными инфекциями дыхательных путей соответствует сниженной эффективности проводимой таким больным антибактериальной терапии с применением бета-лактамных препаратов первой линии, а также более частому появлению необходимости назначения антибиотиков резерва, включая бета-лактамные препараты, устойчивые к большинству бета-лактамаз (карбапенемы, цефалоспорины 4-го поколения, ингибитор-защищенные препараты), а также антибиотики резерва, не относящиеся к группе бета-лактамов. Так, при уровне бета-лактамазной активности мокроты, превышающем 20%, риск неудачи стартовой эмпирической терапии с использованием бета-лактамных препаратов первого ряда повышается в 2,0-3,1 раза по сравнению с пациентами, имеющими низкий уровень бета-лактамазной активности мокроты (использовалось несколько критериев оценки эффективности антибактериальной терапии). При этом далеко не всегда (лишь в 37% случаев) из образцов мокроты были получены культуры патогенных микроорганизмов, продуцирующие бета-лактамазы, что подчеркивает важное преимущество тест-системы «БиоЛактам» перед классическими бактериологическими методами обследования – она позволяет выявлять бета-лактамазную активность биологических жидкостей, минуя этап выделения чистой культуры возбудителя, что уменьшает время анализа в целом, а также резко увеличивает вероятность получения пригодного для анализа результата исследования.
При уровне бета-лактамазной активности мокроты, превышающем 20%, рекомендуется назначать больным с бактериальной патологией респираторного тракта ингибитор-защищенные бета-лактамы, цефалоспорины 4 поколения, карбапенемы, либо, при необходимости, антибактериальные препараты из других фармакологических групп со сходным спектром антимикробной активности.

3.3. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности в спинномозговой жидкости при помощи тест-системы «БиоЛактам»

Пробы спинномозговой жидкости (СМЖ) забираются при проведении диагностических люмбальных пункций. Собранные пробы СМЖ допустимо хранить при ?20°С при условии однократного размораживания непосредственно перед исследованием. При наличии выраженной мутности проб СМЖ необходимо перед исследованием отделить прозрачный надосадок центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут.
Относительно высокая (более 40%) бета-лактамазная активность СМЖ соответствует приблизительно удвоенной (1,9-3,2 раза) вероятности неудачи стартовой эмпирической антибактериальной терапии гнойных менингитов, что выражается в необходимости замены первоначально назначенной схемы лечения на антибиотики резерва, включая сильнодействующие бета-лактамные препараты (карбапенемы, цефалоспорины 4-го поколения) и антибиотики второй линии из других фармакологических групп (гликопептиды, оксазолидиноны, рифампицин, хлорамфеникол и т.д.). Кроме того, отмечена тенденция к снижению цитоза в ликворе на фоне первоначально назначенной антибактериальной терапии у пациентов с низкой бета-лактамазной активностью СМЖ, и к нарастанию цитоза – у лиц с высокой бета-лактамазной активностью ликвора (при условии, что первоначальная схема терапии включала бета-лактамные препараты первого ряда).
Высокая бета-лактамазная активность ликвора связана с размножением в нем S. аureus, гемофилов или энтеробактерий, способных продуцировать бета-лактамазы; указанные возбудители вызывают приблизительно 21,2% всех регистрируемых гнойных менингитов. Нередко возбудители гнойно-воспалительных поражений ЦНС не выделяляются из СМЖ, что еще раз подчеркивает важное преимущество тест-системы «БиоЛактам» над классическими методами бактериологического анализа – данная тест-система позволяет количественно оценивать бета-лактамазную активность биологических жидкостей без необходимости выделения из них чистой культуры возбудителя заболевания, что уменьшает время, необходимое для анализа, а также существенно повышает информативность получаемых результатов.
При уровне бета-лактамазной активности СМЖ, превышающем 40%, рекомендуется назначать больным с поражениями ЦНС бактериальной природы антибиотики, устойчивые к воздействию бета-лактамаз, с учетом их способности проходить через гемато-энцефалический барьер (карбапенемы, за исключением имипенема, фторхинолоны, аминогликозиды, ванкомицин, линезолид и т.п.); к сожалению, ингибитор-защищенные бета-лактамы ограниченно проникают через гемато-энцефалический барьер, вследствие чего их использование при бактериальных менингитах/ менингоэнцефалитах носит ограниченный характер.

3.4. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности в сыворотке крови жидкости при помощи тест-системы «БиоЛактам»

Сыворотка крови исследуемых пациентов отделяется центрифугированием цельной свежеполученной крови, выдержанной в холодильной камере при +4°С в течение 4-6 часов для образования фибринного сгустка, при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная сыворотка крови может сохраняться в морозильной камере при ?20°С при условии однократного размораживания пробы непосредственно перед исследованием.
Бета-лактамазная активность сыворотки крови в большинстве случаев обусловлена альбуминовой фракцией. Помимо ЧСА, большинство белковых фракций крови обладает бета-лактамазной активностью, составляющей приблизительно 9,6% от общей сывороточной. Поликлональные IgG также обладают собственной бета-лактамазной активностью, их вклад в общей сывороточной активности составляет 10-15%. При тяжелом течении инфекционных заболеваний происходит перераспределение роли факторов, опосредующих сывороточную бета-лактамазную активность: относительный вклад ЧСА снижается, а поликлональных IgG – растет; данный феномен объясняется изменением конформации молекул ЧСА вследствие некоторого снижения рН, и, возможно, вследствие изменения редокс-потенциала крови.
Сывороточной бета-лактамазная активность зависит от рН, температуры (при повышении температуры до 39-40°С существенно возрастает) и ионной силы раствора (снижается при повышении ионной силы выше уровня, типичного для плазмы крови).
Как правило, определяется группа лиц с высокой (более 68,2%) бета-лактамазной активностью сыворотки крови, тяжелым течением инфекционных заболеваний бактериальной природы (пневмоний, менингитов, менингоэнцефалитов), значительной продолжительностью антибактериальной терапии, частой сменой антибиотиков и нередким назначением антибактериальных препаратов резерва всех групп. Замена таким больным бета-лактамных препаратов первой линии на препараты резерва (ингибитор-защищенные бета-лактамы, цефалоспорины 4 поколения, карбапенемы, гликопептиды, оксазолидиноны, респираторные фторхинолоны и т.п.) приводит к сокращению срока госпитализации в среднем на 4,6 суток (p=0,003).
Тест-система «БиоЛактам» пригодна для качественного и количественного анализа бета-лактамазной активности биологических жидкостей, в частности, сыворотки крови, мокроты и спинномозговой жидкости, а также бактериальных суспензий. Уровень бета-лактамазной активности мокроты и СМЖ более 40%, а сыворотки крови – более 68,2% требует отмены больным бета-лактамных препаратов первого ряда и назначения антибиотиков резерва, в частности, ингибитор-защищенных бета-лактамов, карбапенемов либо препаратов из других фармакологических групп с аналогичным спектром антимикробной активности.
При анализе бактериальной взвеси с помощью тест-системы «БиоЛактам» можно с высокой степенью достоверности определить:
– факт продукции клинически значимых количеств бета-лактамаз при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии ? 8,7% (чувствительность данного теста составляет 76,4%, специфичность – 82,8%);
– факт устойчивости к ингибитор-защищенным бета-лактамам при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии ? 26,5% (чувствительность данного теста составляет 79,2%, специфичность – 79,3%);
– факт устойчивости к цефалоспоринам 3-го поколения при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии ? 81,2% (чувствительность данного теста составляет 82,4%, специфичность – 94,7%);

ЛИТЕРАТУРА

1. ДНК-гидролизующие IgG антитела из крови больных некоторыми инфекционными заболеваниями / Е.С. Одинцова [и др.] // Иммунопатол., аллергол., инфектол. – 2006. – №2. – С. 49-55.
2. Семенов, В.М. Микробиологические и биологические аспекты резистентности к антимикробным препаратам / В.М.Семенов, Т.И.Дмитраченко, И.В. Жильцов // Медицинские новости – 2004. – №2 – С. 7-12.
3. Особенности «биологической» антибиотикоустойчивости при шигеллезах: выявление in vivo поликлональных IgG, обладающих пенициллиназной активностью / И.В. Жильцов [и др.] // Медицинская панорама. – 2006. – №5, Том 62. – С. 46-48.
4. Этиология и лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов / Н.А. Малышев [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2005. – №3. – С. 5-9.
5. A secondary drug resistance mutation of TEM-1 beta-lactamase that suppresses misfolding and aggregation / V. Sideraki [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – Vol. 98, №1. – P. 283-288.
6. A suicide-substrate mechanism for hydrolysis of beta-lactams by an anti-idiotypic catalytic antibody / S. Lefevre [et al.] // FEBS Lett. – 2001. – Vol. 489, №1. – P. 25-28.
7. Abeylath, S.C. Drug delivery approaches to overcome bacterial resistance to beta-lactam antibiotics / S.C. Abeylath, E. Turos // Expert. Opin. Drug. Deliv. – 2008. – Vol. 5, №9. – P. 931-949.
8. Analysis of resistant genes of beta-lactam antibiotics from Pseudomonas aeruginosa in pediatric patients / F. Dong [et al.] // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. – 2008. – Vol. 88, №42. – P. 3012-3015.
9. Ananthan, S. Cefoxitin resistance mediated by loss of a porin in clinical strains of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli / S. Ananthan, A. Subha // Indian J. Med. Microbiol. – 2005. – Vol. 23, №1. – P. 20-23.
10. Antibodies against chromosomal beta-lactamase / B. Giwercman [et al.] // Antimicrob. Agents. Chemother. – 1994. – Vol. 38, №10. – P. 2306-2310.
11. Assays for beta-lactamase activity and inhibition / T. Viswanatha [et al.] // Methods Mol. Med. – 2008. – Vol. 142. – P. 239-260.
12. Avalle, B. Functional mimicry: elicitation of a monoclonal anti-idiotypic antibody hydrolizing beta-lactams / B. Avalle, D. Thomas, A. Friboulet // FASEB J. – 1998. – Vol. 12, №11. – P. 1055-1060.
13. Catalytic mechanism of an abzyme displaying a beta-lactamase-like activity / B. Avalle [et al.] // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2000. – Vol. 83, №1-3. – P. 163-169.
14. Cavallo, J.D. Surveillance of Pseudomonas aeruginosa sensitivity to antibiotics in France and distribution of beta-lactam resistance mechanisms: 1998 GERPB study / J.D. Cavallo, F. Leblanc, R. Fabre // Pathol. Biol. (Paris). – 2000. – Vol. 48, №5. – P. 472-477.
15. DNA-hydrolyzing activity of IgG antibodies from the sera of patients with diseases caused by different bacterial infections / T.A. Parkhomenko [et al.] // J. Cell. Mol. Med. – 2008. – Vol. 13, Issue 9a. – P. 2875-2887.
16. Drawz, S.M. Three decades of beta-lactamase inhibitors / S.M. Drawz, R.A. Bonomo // Clin Microbiol Rev. – 2010. – Vol. 23, №1. – P. 160-201.
17. Gonz?lez, J.M. Evidence of adaptability in metal coordination geometry and active-site loop conformation among B1 metallo-beta-lactamases / J.M. Gonz?lez, A. Buschiazzo, A.J. Vila // Biochemistry. – 2010. – Vol. 49, №36. – P. 7930-7938.
18. Jerne, N.K. Towards a network theory of the immune system / N.K. Jerne / Ann. Immunol. (Inst. Pasteur). – 1974. – Vol. 125, №1-2. – P. 373-389.
19. Mutational upregulation of a resistance-nodulation-cell division-type multidrug efflux pump, SdeAB, upon exposure to a biocide, cetylpyridinium chloride, and antibiotic resistance in Serratia marcescens / H. Maseda [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 2009. – Vol. 53, №12. – P. 5230-5235.
20. Overpassing an aberrant V(kappa) gene to sequence an anti-idiotypic abzyme with (beta)-lactamase-like activity that could have a linkage with autoimmune diseases / H. Debat [et al.] // FASEB J. – 2001. – Vol. 15, №3. – P. 815-822.
21. P?rez-Llarena, F.J. Beta-lactamase inhibitors: the story so far / F.J. P?rez-Llarena, G. Bou // Curr. Med. Chem. – 2009. – Vol. 16, №28. – P. 3740-3765.
22. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 ? / M. Wardell [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2002. – Vol. 291, №4. – P. 813-819.
23. Walter, E. Hydrolysis of 3-Acetoxymethyl Cephalosporins by Lysed Whole Blood / E. Walter Wright, A. Judith Frogge // Antimicrobial Agents And Chemotherapy. – 1980. – Vol. 17, № 1. – P. 99-100.