Задать вопрос

Тест-система Био-Лактам признана на государственном уровне

Министерство здравоохранения Республики Беларусь рекомендует организациям здравоохранения перед назначением антибактериальной терапии рассматривать необходимость осуществления мероприятий по определению уровня бета-лактамазной активности.

 

Министерство здравоохранения Республики Беларусь информирует о нижеследующем. В рамках Белорусской инновационной недели, проводившейся с 1 5 по 18 ноября 2011 г. в г. Минске, первого места в номинации «Лучший инновационный проект» был удостоен проект по разработке тест-системы «БиоЛактам».
Тест-система «БиоЛактам», разработанная учреждением образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», предназначена для определения и количественной опенки бета-лактамазной активности биологических субстратов, что необходимо для решения вопроса о целесообразности применения бета-лактамных антибиотиков в лечении пациентов.
Тест-система зарегистрирована Министерством здравоохранения Республики Беларусь (регистрационный номер Мн-7.115570-1011). В настоящее время организован промышленный выпуск отечественным производителем (ТУ BY 391353648.001-2011).
В основе функционирования тест-системы «БиоЛактам» лежит методика, базирующаяся на изменении окраски синтетического антибиотика цефалоспоринового ряда при распаде его бета-лактамной связи. При этом происходит батохромный сдвиг в хромофорной системе молекулы, и окраска реакционной смеси меняется с желтой на красно-оранжевую. Максимум поглощения продукта реакции меняется с 390 нм на 486 нм, что и делает возможным спектрофотометрическую детекцию. Бета-лактамазная активность оценивается в % распада стандартного количества используемого цефалоспорина, вносимого в пробу.

Измерение оптической плотности проводится с применением ИФА-анализаторов.
В настоящее время наиболее часто используемыми средствами при лечении инфекций различной локализации в стационарах и амбулаторной сети Республики Беларусь являются бета-лактамные антибактериальные препараты (аминопенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы).
Отсутствие эффекта при применении бета-лактамных антибиотиков в лечении пациентов в ряде случаев связано с двумя причинами:
1. Наличие биологической резистентности, связанной с разрушением бета-лактамных антибиотиков в сыворотке крови и других биологических жидкостях (плевральная жидкость, перитонеальная жидкость и др.) под воздействием бета-лактамазной активности, обусловленной альбуминовой и глобулиновой фракциями.
2. Наличие микробиологической резистентности, обусловленной разрушением антибиотиков в биологических жидкостях, связанной с активным ростом и размножением микроорганизмов, продуцирующих бета-лактамазы, разрушающие бета-лактамное кольцо, являющееся основой структуры бета-лактамных антибиотиков (спинномозговая жидкость, мокрота, моча, слюна, плевральная жидкость, перитонеальная жидкость, суточная культура посевов инфицированного материала).
Способность к продукции бета-лактамаз в различных концентрациях выявляется у множества бактерий, как грам (+), так и грамм (-). Практически все бактерии способны синтезировать данные ферменты. Микроорганизмы могут иметь природную способность продуцировать бета-лактамазы благодаря наличию соответствующих генов в своей хромосоме, либо приобретают данную возможность после успешной трансдукции ДНК от другого микроорганизма (обычно в составе перевиваемых R-плазмид). На данный момент выявлены 4 основных класса бета-лактамаз — А, В, С и D. Природная либо приобретенная способность продуцировать бета-лактамазы — ферменты, способные гидролизовать эндоциклическую пептидную связь в бета-лактамных антибиотиках, — является основным механизмом постоянно возрастающей резистентности бактерий к данному классу антибактериальных препаратов, что приводит к клинической неэффективности использования антибиотиков и связанному с этим возникновению осложнений, ухудшению прогноза заболеваний, удлинению сроков лечения и госпитализации пациентов. Общепризнанно, что формирование новых бета-лактамаз с измененными структурой и механизмом действия — наиболее распространенный механизм адаптации микроорганизмов к введению в клиническую практику новых бета-лактамных препаратов т.е., фактически, ответ бактерий на эволюционное давление, создаваемое применением соответствующих схем терапии, особенно среди грам (-) бактерий.


1. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности бактериальной взвеси при помощи тест-системы «БиоЛактам»
Исходным материалом для приготовления суспензий являются чистые культуры бактерий, растущие на поверхности питательных сред (Эндо либо Ресселя — для энтеробактерий, желточно-солевом агаре — для стафилококков) в пробирках с «косым агаром». В пробирку с питательной средой вносится 2-3 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия. После этого пробирка энергично встряхивается до тех пор, пока жидкость над агаром не станет опалесцируюшей. Затем жидкость извлекается из пробирки и (при необходимости) разводится стерильным физиологическим раствором хлорида натрия до 0,5 ЕД стандарта мутности Макфарланда путем сравнения с эталоном. Чувствительность анализа повышается, если бактериальная взвесь перед анализом подвергается однократному замораживанию-оттаиванию.
При уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии, равном или превышающем 8,7%, соответствующий возбудитель продуцирует клинически значимые количества бета-лактамаз, что приводит к существенному снижению эффективности антибиотиков бета-лактамного ряда (кроме цефалоспоринов 3-4 поколения, карбапенемов, монобактамов и ингибитор-защищенных препаратов). Если бета-лактамазная активность бактериальной взвеси равна или превышает 13,4%, то соответствующий возбудитель устойчив и к ингибитор-защищенным бста-лактамам. Тест-система «БиоЛактам» позволяет с высокой степенью достоверности получать ряд важных сведений об устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам бета-лактамного ряда, что является необходимым условием для проведения рациональной антибактериальной терапии.
Тест-система «БиоЛактам» не конкурирует с диско-диффузионным методом, а дополняет его, позволяя получать важную информацию о природе антибиотикоустойчивости микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. К числу преимуществ тест-системы «БиоЛактам» относится небольшое время, необходимое для анализа (0,5-1 час) по сравнению с диско-диффузионным методом (от 24 часов), а также высокая воспроизводимость результатов (традиционно слабое место диско-диффузионного метода).
Разработанная тест-система оптимальна для определения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам бактерий (различных штаммов кишечной палочки, псевдомонад, сальмонелл, шигелл, цитробактера, протея, клебсиелл, гемофилов и др.), поскольку их устойчивость к бета-лактамным антибиотикам опосредуется почти исключительно продукцией разнообразных бета-лактамаз.


2. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности в мокроте при помощи тест-системы «БиоЛактам».
Перед исследованием пробирки с образцами мокроты выдерживаются в ультразвуковой ванне в течение 30 минут при 37°С с целью дезинтеграции плотных комочков мокроты и гноя и перехода их содержимого в раствор; интенсивно встряхиваются на вортексе в течение 5 минут до полного перемешивания содержимого, и центрифугируются при 12.000 об/мин в течение 5 минут. По окончании центрифугирования отделяется прозрачный надосадок, который используется для анализа, вязкая же часть мокроты (осадок) аннулируется.
Бета-лактамазная активность мокроты обусловлена продукцией бета-лактамаз бактериями — возбудителями бронхолегочных заболеваний, а уровень данной активности пропорционален интенсивности продукции бета-лактамаз. Высокий уровень бета-лактамазной активности мокроты пациентов с бактериальными инфекциями дыхательных путей вызывает необходимость назначения антибиотиков резерва, включая бета-лактамные препараты, устойчивые к большинству бета-лактамаз (карбапенемы, цефалоспорины 4-го поколения, ингибитор-защищенные препараты), а также антибиотики резерва, не относящиеся к группе tSeTa-лактамов. При уровне бета-лактамазной активности мокроты, превышающем 20%, риск неудачи стартовой эмпирической терапии с использованием бета-лактамных препаратов первого ряда повышается в 2,0-3,1 раза по сравнению с пациентами, имеющими низкий уровень бета-лактамазной активности мокроты. При этом преимущество тест-системы «БиоЛактам» перед классическими бактериологическими методами заключается в том, что она позволяет выявлять бета-лактамазную активность биологических жидкостей, минуя этап выделения чистой культуры возбудителя, что уменьшает время анализа в целом, снижает стоимость исследования и резко увеличивает вероятность получения пригодного для анализа результата.
При уровне бета-лактамазной активности мокроты, превышающем 20%, рекомендуется назначать пациентам с бактериальной патологией респираторного тракта ингибитор-защищенные бета-лактамы, цефалоспорины 4 поколения, карбапенемы, либо, при необходимости, антибактериальные препараты из других фармакологических групп со сходным спектром антимикробной активности.
3. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности в спинномозговой жидкости при помощи тест-системы «БиоЛактам»
Пробы спинномозговой жидкости (СМЖ) забираются при проведении диагностических люмбальиых пункций.


Собранные пробы СМЖ допустимо хранить при -20°С при условии однократного размораживания непосредственно перед исследованием. При наличии выраженной мутности проб СМЖ необходимо перед исследованием отделить прозрачный надосадок центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут.
Относительно высокая (более 40%) бета-лактамазная активность СМЖ соответствует (1,9-3,2 раза) вероятности неудачи стартовой эмпирической антибактериальной терапии гнойных менингитов, что выражается в необходимости замены первоначально назначенной схемы лечения на антибиотики резерва, включая бета-лактамные препараты (карбапенемы, цефалоспорины 4-го поколения) и антибиотики второй линии из других фармакологических групп (гликопептиды, оксазолидиионы, рифампицин, хлорамфеникол и т.д.).
Высокая бета-лактамазная активность ликвора связана с размножением в нем S. aureus, гемофилов или энтеробактерий, способных продуцировать бета-лактамазы; указанные возбудители вызывают 2] ,2% всех регистрируемых гнойных менингитов. Нередко возбудители гнойно-воспалительных поражений ЦНС не выделяются из СМЖ, что подчеркивает важное преимущество тест-системы «БиоЛактам» над классическими методами бактериологического анализа. Данная тест-система позволяет количественно оценивать бета-лактамазную активность биологических жидкостей без необходимости выделения из них чистой культуры возбудителя заболевания, что уменьшает время, необходимое для анализа, а также существенно повышает информативность получаемых результатов.
При уровне бета-лактамазной активности СМЖ, превышающем 40%, рекомендуется назначать пациентам с поражениями ЦНС бактериальной природы антибиотики, устойчивые к воздействию бета-лактамаз, с учетом их способности проходить через гемато-энцефалический барьер (карбапенемы, за исключением имипенема, фторхинолоны, аминогликозиды, ванкомицин, линезолид и т.п.). Ингибитор-защищенные бета-лактамы ограниченно проникают через гемато-энцефалический барьер, вследствие чего их использование при бактериальных менингитах/ менингоэнцефалитах носит ограниченный характер.
4. Определение и количественная оценка бета-лактамазной активности в сыворотке крови, в плевральной и перитонеальной жидкостях при помощи тест-системы «БиоЛактам»
Сыворотка крови исследуемых пациентов отделяется центрифугированием цельной свежеполученной крови, выдержанной в холодильной камере при +4°С в течение 4-6 часов для образования фибринного сгустка, при 3000 об/мин в течение 15 минут.


Полученная сыворотка крови может сохраняться в морозильной камере при -20°С при условии однократного размораживания пробы непосредственно перед исследованием.
Бета-лактамазная активность сыворотки крови, плевральной или перитонеальной жидкостей в большинстве случаев обусловлена альбуминовой фракцией. При тяжелом течении инфекционных заболеваний происходит перераспределение роли факторов, опосредующих сывороточную бета-лактамазную активность: относительный вклад ЧСА снижается, а поликлональных IgG — растет; данный феномен объясняется изменением конформации молекул ЧСА вследствие некоторого снижения рН, и, возможно, вследствие изменения редокс-потенциала крови.
Сывороточная бета-лактамазная активность зависит от рН, температуры (при повышении температуры до 39-40°С существенно возрастает) и ионной силы раствора (снижается при повышении ионной силы выше уровня, типичного для плазмы крови).
Как правило, определяется группа лиц с высокой (более 68,2%) бета-лактамазной активностью сыворотки крови или перитонеальной и плевральной жидкостей, тяжелым течением инфекционных заболеваний бактериальной природы, значительной продолжительностью антибактериальной терапии, частой сменой антибиотиков и нередким назначением антибактериальных препаратов резерва всех групп. Замена таким пациентам бета-лактамных препаратов первой линии на препараты резерва (ингибитор-защищенные бета-лактамы, цефалоспорины 4 поколения, карбапенемы, гликопептиды, оксазолидиноны, респираторные фторхинолоны и т.п.) приводит к сокращению срока госпитализации в среднем на 4,6 суток.
Применение тест-системы «БиоЛактам» не требует наличия в организации здравоохранения бактериологической лаборатории. Определение бета-лактамазной активности тест-системой «БиоЛактам» характеризуется высокой чувствительностью (70%), специфичностью (90%) и воспроизводимостью. Она проста в выполнении, не требует специфического оборудования и специально обученного персонала.
Определение биологической и микробиологической резистентности к бета-лактамным антибиотикам в ранние сроки заболевание позволяет своевременно провести коррекцию лечения и снизить частоту необоснованного назначения бета-лактамных антибиотиков на 20-30%, что приведет к сокращению сроков госпитализации профильных пациентов и существенной экономии денежных средств.
Министерство здравоохранения Республики Беларусь рекомендует организациям здравоохранения перед назначением антибактериальной терапии рассматривать необходимость осуществления мероприятий по определению уровня бета-лактамазной активности.
Вносится в порядке информирования о результатах научно-исследовательской деятельности государственных медицинских (фармацевтических) научных организаций.

Scan Тест система Био Лактам признана на государственном уровне

Scan1 Тест система Био Лактам признана на государственном уровне